Southern Blot 实验流程（包括原理/细节）

一、DNA 的提取

人和哺乳动物细胞基因组DNA的分离通常是在有EDTA、Sarkosye等一类去污剂存在下，用蛋白酶K消化细胞，随后用酚、氯仿抽提，经RNase 处理和纯化来提取DNA。

(1)取单层细胞，经无钙、镁PBS洗一次，用0.25%胰蛋白酶消化，细胞悬液经PBS洗2次,弃上清，取细胞沉淀。

(2)加入2ml细胞裂解液(10mM Tris HCL，pH8.0，0.1mol/L EDTA，10mmol/L NaCL，1% SDS)充分混匀，加入蛋白酶K 至终浓度为0.5～1g/L、Sarkosye终浓度为0.5%，混匀裂解蛋白呈糊状。

(3)50℃水浴2h，转入37℃水浴过夜，次日加入等体积饱和酚，轻轻颠倒混匀，以防止DN A断裂，约3min。

12000r/min 离心15分钟（室温）

(4)取水相，再加入等体积酚/氯仿(1:1),同样颠倒混匀，去除蛋白质

12000 r/min 离心15分钟（室温）

(5)再重复步骤(4)，再用等体积酚/氯仿(1:1)抽提一次

(6)取水相，再加入等体积氯仿，去除酚及蛋白质，颠倒混匀

12000 r/min 离心15分钟（室温）

(7)取水相，加入2倍体积的预冷无水乙醇，沉淀DNA，混匀-20℃放置1小时

12000 r/min 离心15分钟（室温）

(8)用70%乙醇洗涤一次，按上法离心将沉淀真空干燥10分钟。

(9)加入RNase A至终浓度100mg/L，37℃水浴消化1小时，消化污染的RNA。

(10)加入蛋白酶K 至终浓度0.4g/L、Sarkosye至终浓度0.5%，混匀，50℃水浴2小时，加入NaAC至终浓度10mmol/L。

(11)用等体积饱和酚各抽提一次，步骤同前。